在缺氧环境中，活性污泥中的部分细菌，如变形杆菌、微球菌属、芽孢杆菌、产碱杆菌等会改变其呼吸方式，从有氧方式转换为兼氧呼吸方式，以维持其生命活动；同时将硝态氮转化为氮气或氮氧化物。这种转化过程称之为反硝化过程，而将硝态氮转化为氮气或氮氧化物的细菌称之为反硝化菌，转化过程如下：
在pH为中性至弱碱性的厌氧环境中，氮气（N2）是主要产物；在低pH和高溶解氧的环境中，一氧化二氮（N2O）是主要产物；由于二沉池水中的溶解氧浓度非常低，因此也有类似反应并导致浮泥，这就是常见的反硝化浮泥。
另外，无论在缺氧区还是在好氧区，由于微生物的细胞合成会直接将氨氮或者将硝态氮转化成氨氮后用于构成细胞物质，也可以降低废水中氮的含量，这就是大家所说的同化过程。
相对于硝化过程，反硝化过程的控制较为简单，其要点主要如下：
1.溶解氧：当水中的溶解氧浓度高于0.2mg/l时，反硝化反应会受到影响，故需要在缺氧池维持溶解氧浓度<0.2mg/l。这与混合液回流量有直接关系，当溶解氧偏高时，需要适当降低混合液回流量。
2.温度：反硝化菌的适宜温度与硝化菌基本相同，上限温度可以耐受到40℃。反硝化反应的速率随着温度的上升而增加，所以若水温偏低，则需要更大容积的缺氧区。
3.碳源：反硝化菌为异养型细菌，以有机碳作为碳源，也就是说反硝化反应需要碳源参与反应。理论上每还原1g NO3-N，需要消耗2.86g有机碳，这一点非常重要，通常必须维持缺氧池进水BOD/TKN>3，才能保证反硝化反应的充分进行，否则需要考虑额外补充碳源。