反硝化反应是将硝化反应过程中产生的硝酸盐和亚硝酸盐还原成N2的过程。反硝化细菌包括假单胞菌属，反硝化杆菌属，螺旋菌数和无色杆菌属等，是一类化能异氧兼性微生物。在有分子态氧存在时，它们以有机物为底物对其进行氧化分解，并以氧作为最终电子受体，而在缺氧条件下，则利用废水中各种有机基质作为碳源和电子供体，以NO2--N和NO3--N作为电子受体而进行缺氧呼吸，通过异化和同化作用完成反硝化脱氮过程。同化反硝化最终形成有机氮化合物，成为菌体的组成部分，异化反硝化最终产物是气态氮。
首先由黄素蛋白FAD或FMN接受从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH2转移来的电子，并将它转移给醌和细胞色素b，然后将电子转移给含钼的硝酸盐还原酶，使Mo6+还原为Mo5+，而Mo5+再将电子转移给NO3--N而使其还原为NO2--N。
影响反硝化生物处理的环境因素有碳源、pH、溶解氧和温度；控制因素有水力搅拌强度、硝化液回流比、污泥浓度、泥龄等。
反硝化系统需要碳源，碳源是有机物。在市政污水处理厂中，入网的生活污水可生化性较好，其中BOD占比较高，可以做反硝化细菌所需的碳源，但是多数情况下该部分碳源的含量不足。尤其是纳管混入工业废水后，所有指标均可能升高。TN升高的同时，BOD的占比降低，反硝化所需的碳源更加不足，需要外加碳源。